引言
抗体实验中，大家往往更关注一抗的选择，而忽视了二抗的正确搭配。但其实，二抗是否选对，直接影响信号强弱与背景水平。今天我们就来系统梳理不同免疫学实验中常见的二抗选择原则，并特别解析IP-WB中“二抗乱象”背后的关键逻辑。abinscience提供高品质二抗产品，支持您的实验需求。
Fig.1.抗体实验中一抗与二抗的搭配示意图
常见实验的二抗选择策略
实验类型
常用二抗选择
注意事项
Western Blot (WB)
HRP/近红外标记二抗（Goat anti-X IgG）
确保与一抗种属匹配；WB多选HRP/IRDye标记，避免一抗与二抗同种属且无交叉吸附
免疫荧光（IF）
Alexa Fluor/FITC标记二抗
避免荧光共谱；优选交叉吸附型二抗以减少背景
免疫组化（IHC）
Biotin/HRP/AP标记二抗
与显色系统兼容（DAB/NBT）；组织特异性背景需考虑交叉吸附
流式细胞术（FCM）
PE/APC/FITC标记二抗
通道荧光需兼容，避免交叉信号干扰；优选F(ab')₂去Fc段结构
ELISA
Biotin/HRP/AP标记二抗
注重酶标敏感性；比色用HRP/AP，荧光用荧光素酶
免疫沉淀+WB（IP-WB）
经特殊去异源交叉吸附的二抗
重叠宿主组合时需避免识别IP抗体，详见下节
Fig.2.二抗选择解析
什么是交叉吸附二抗？
交叉吸附（Cross-adsorbed）是指二抗经过特殊处理，去除了会与非目标物种IgG发生非特异性结合的部分。
Fig.3.交叉吸附（Cross-Adsorption or Pre-Adsorption）二抗工作原理图
这样可以显著降低背景、提高特异性，尤其适合组织样本、流式、多标染色等对信噪比要求较高的实验。abinscience提供经过优化处理的交叉吸附二抗。
IP-WB 中的二抗如何选？
免疫沉淀（IP）后接WB检测的组合，最容易踩坑的一项，就是二抗“识别了IP用的一抗”，导致假阳性或重影带。以下是不同组合推荐用法整理（建议收藏）：
一抗类型
WB检测二抗推荐
备注说明
小鼠单抗
HRP-标记Protein A 或交叉吸附小鼠IgG二抗
HRP-Protein A可识别IgG Fc段，避免二抗干扰
小鼠多抗
HRP-标记兔IgG二抗
确保样本不含兔IgG背景
兔多抗
HRP-标记交叉吸附兔IgG二抗
减少与样本中内源性兔IgG交叉反应
兔单抗
同上（优选去除人/鼠/羊交叉二抗）
特别推荐abinscience、CST、Jackson等品牌交叉吸附二抗
使用Protein A或G做IP
HRP-抗兔/小鼠IgG二抗（根据一抗）
二抗应避免识别结合到beads上的Protein A残留抗体
Fig.4.IP-WB中二抗选择与假阳性对比图
总结建议
✅ 一抗与二抗种属匹配，是基本原则
✅ 同种属操作（如兔抗+兔样本），优先使用交叉吸附二抗
✅ IP-WB组合需关注“是否识别到IP步骤中的一抗”
✅ 多重染色、流式实验中建议选用去Fc段结构（F(ab')₂）与交叉吸附型二抗
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参考文献
Sharma S, et al. Guidelines for antibody use in physiology research. Am J Physiol. 2017.